A imuno-fluorescência é uma técnica histológica de imuno-marcação bastante difundida. Nela a revelação das proteínas-alvo se dá pela associação de um fluoróforo ao antígeno.

Se na imuno-histoquimica preservamos os aspectos morfológicos do tecido, nesta técnica podemos marcar mais de uma proteína simultâneamente, o que nos permite correlacionar marcações em tecidos. Para isto usa-se anticorpos desenvolvidos em diferentes espécies, o que preserva a especificidade da marcação de cada proteína.

Normalmente usa-se um marcador de DNA (DAPI) para compensar a ausência de uma contra-coloração capaz de situar o observador nas diferentes regiões do tecido.

Para a observação de imuno-fluorescência, necessitamos de um microscópio de fluorescência com os “cubos” de fluorescência apropriados. A observação de marcações múltiplas é facilitada na microscopia confocal.

A quantificação de fluorescência segue os princípios da análise de imuno-histoquimica. O uso de um anti-fade é recomendável para preservar a emissão de fotons nas lâminas, permitindo que as observações sejam potencialmente equivalentes ao longo da captura das imagens. É normalmente um meio de montagem das lâminas.

Neste tipo de análise frequentemente nos deparamos com um problema básico de quantificação. As imagens não possuem distribuição randômica dos objetos no campo, devido ao fato de que, pela necessidade de um ponto de referência para a obtenção de um plano focal, captura-se a imagem com núcleos, citoplasma e matriz extracelular.  Se a nossa estrutura está especificamente em um destes compartimentos, espera-se que sua distribuição não seja uniforme no campo. Para contornar isso usamos amostradores na imagem, normalmente denominados AOIs (oriundo do termo area of interest) nos programas de análise de imagens, dispostos no compartimento que desejamos analisar.

 

Os colágenos são proteínas da matriz extracelular de extrema importância na estrutura e regeneração dos tecidos. Estão presentes em praticamente todos os tecidos representado entre 25% a 35% das proteínas encontradas no corpo dos mamíferos.

Sua presença ou ausência em determinados tecidos representa estados metabólicos distintos o que confere a eles um papel morfológico importante na caracterização de algumas patologias. São subdivididos em 11 tipos, cada um com funções distintas.

O PSR (Picrossirius Red) é uma técnica histoquímica bastante empregada na detecção de colágenos em tecidos. Tecidos corados com PSR podem ser observados em microscopia de campo claro, de polarização ou em microscopia confocal.

A observação em microscopia de polarização é particularmente interessante para a análise computacional de imagens. Por esta técnica, o colágeno se destaca do restante do tecido assumindo uma coloração brilhante. A polarização facilita a segmentação de cores para a quantificação.

Embora as variações de cor na imagem polarizada sugiram a presença de mais de um tipo de colágeno, não é seguro afirmarmos a proporção de colágenos presentes em um campo por esta técnica. Usa-se a imuno-histoquimica ou imuno-fluorescência para esta finalidade.

Os pressupostos descritos no artigo Quantificação de Imuno-histoquímica se aplicam a este tipo de análise. Acrescenta-se a estes, a polarização racional dos campos. As imagens polarizadas são obtidas pela rotação do polarizador. O fundo claro e as estruturas não coradas pelo PSR ficam escuras na medida que este é girado. Em contrapartida, o colágeno presente vai ficando mais brilhante. Desta forma o grau de alinhamento entre o polarizador e o analisador pode influenciar na revelação do colágeno observado no campo. Na prática, giramos o polarizador até que o fundo fique completamente escuro. Se continuamos girando o fundo volta a clarear, então retornamos o giro no sentido contrário até que o fundo se mostre o mais escuro possível.

Os passos seguintes para esta análise são semelhantes aos usados na análise da imuno-histoquimica, a saber:

1 – abro uma imagem contida em um diretório.

2 – faço uma segmentação de cores por amostragem, contrastando o que é marcação do que não é marcação. Devemos escolher uma cor de segmentação diferente do vermelho ou amarelo, para que possamos reconhecer o que está sendo incluído.

3 – quantifico a área ocupada por marcação em relação à área total da imagem.

4 – salvo os resultados em uma planilha eletrônica, para posterior formatação e análise estatística.

Protótipo de quantificação de colágeno em microscopia de polarização com o uso do Image Pro Plus (Media Cybernetics)